Полимеразная цепная реакция, также известная как ПЦР, является сложной диагностической технологией, способной обнаруживать инфекционные и вирусные заболевания. Подробнее о том, чем является ПЦР-диагностика, какими преимуществами она обладает и какие этапы проведения ее включает, мы расскажем в этой статье.

В частности, ПЦР-диагностика основывается на увеличении количества конкретной ДНК-части в образце, что позволяет ее определить в микроскопических количествах. Это обеспечивает высокую точность диагностики даже в случае незначительной концентрации заболевания.

Одним из главных преимуществ ПЦР-метода является его высокая чувствительность и специфичность, которые существенно повышают точность результатов тестов. Кроме того, ПЦР-диагностика может быть использована для обнаружения нескольких заболеваний одновременно, что экономит время и средства.

Этапы проведения ПЦР-диагностики включают подготовку образцов, извлечение и очистку ДНК, смешивание ДНК с реактивами, увеличение количества ДНК в циклах и анализ полученных результатов.

Таким образом, ПЦР-диагностика является перспективной и эффективной технологией, которая значительно облегчает задачу постановки диагнозов инфекционных и вирусных заболеваний. Ее преимущества и этапы проведения делают ее достойной конкурентом традиционных методов диагностики.

Существует целый ряд методов диагностики различных заболеваний, однако диагностика методом ПЦР зарекомендовала себя как один из наиболее точных способов выявления инфекций. Методом ПЦР занимаются уже более 30 лет, и за это время он значительно эволюционировал.

Основой метода лежит принцип многократного увеличения микроскопических концентраций фрагментов ДНК возбудителя в биологической пробе пациента в искусственных условиях. Этому способствуют ферменты и изменения температуры (от 50 до 95°С). В результате процесса, называемого амплификацией, из одной молекулы ДНК возбудителя в биологической пробе пациента образуется две. При этом происходит копирование участка ДНК, который присутствует только у того вида патогенного микроорганизма, который интересует врача.

Процесс образования новой молекулы ДНК занимает около 3 минут, и после тридцати-сорока циклов новых молекул становится достаточно для проведения подробного анализа методом электрофореза.

В дополнение к простой амплификации фрагментов ДНК, с помощью ПЦР можно производить и другие манипуляции с генетическим материалом, например, сращивать фрагменты ДНК, вводить мутации и т.д. Из-за этих возможностей ПЦР может использоваться не только для диагностики инфекционных и генетических заболеваний, но и для установления отцовства, клонирования и выделения новых генов.

Процедура ПЦР-диагностики проводится в специальных лабораториях с помощью амплификационного оборудования. Сегодня существует множество различных модификаций ПЦР, включая технологии с использованием не только ДНК, но и фрагментов РНК. В некоторых модификациях можно использовать режим амплификации при постоянной температуре, и для их проведения специальное оборудование не требуется.

Широко применяется такой прием, как «горячий старт ПЦР», при котором пробирки с амплификационной смесью предварительно прогревают при температуре 95°С в течение 3–5 минут, для того чтобы избежать клонирования неспецифических ДНК-фрагментов.

Еще одна популярная модификация ПЦР — мультиплексная амплификация (МПА), которая позволяет проводить исследование сразу нескольких изучаемых фрагментов в одной пробирке. Этот метод не только ускоряет и удешевляет проведение анализа, но и позволяет использовать одни фрагменты, получившиеся в результате реакции, в качестве положительных маркеров для других, что еще больше повышает точность использования ПЦР-диагностики.

Метод ПЦР-диагностики в клинической медицине широко используется во многих областях, включая урогинекологию, неонатологию, службу крови, клинику инфекционных заболеваний, фтизиатрию и пульмонологию.

В урогинекологии, где инфекционные заболевания могут вызвать бесплодие и невынашивание беременности у женщин, метод ПЦР позволяет выявить целый "букет" половых инфекций, включая хламидиоз, микоплазму, уреаплазму, трихомониаз, гарднереллу, кандиду, гонококк и трепонему. Выявление этих инфекций своевременно помогает избежать риска злокачественных заболеваний шейки матки у женщин. Также метод ПЦР используется для выявления вирусов, поражающих урогенитальный тракт обоих полов, в особенности вирус Герпеса и вирус папилломы человека.

В неонатологии метод ПЦР-диагностики позволяет эффективно выявлять наличие неонатальных инфекций как на внутриутробном этапе, так и у новорожденных. К опасным инфекциям относятся цитомегаловирус, токсоплазмы, вирусы краснухи и герпеса, хламидии, микоплазмы.

В службе крови метод ПЦР-диагностики применяется для избежания риска переливания пациентам, инфицированным опасными заболеваниями крови или плазмы, такими как ВИЧ, сифилис, гепатиты. Этот метод превосходит по точности серологические методы, так как он способен выделить даже те инфекции, которые имеют длительный инкубационный период и не определяются при помощи обычных исследований в течение первых нескольких недель.

Клиника инфекционных заболеваний также использует метод ПЦР-диагностики. К ним относятся вирус гепатита, СПИД, сальмонеллез, хеликобактериоз, холера, бруцеллез, туляремия, дифтерия и токсоплазмоз.

В фтизиатрии и пульмонологии метод ПЦР-диагностики позволяет выявить возбудителей атипичных пневмоний и рецидивирующих хронических бронхитов, таких как хламидии и микоплазмы. Кроме того, с помощью этого метода можно не только поставить диагноз, но и провести видовую идентификацию возбудителя, т.е. выявить конкретный штамм. Метод ПЦР также используется для ранней и высокоточной диагностики туберкулеза.

Заметим, что метод ПЦР-диагностики широко используется не только в клинической медицине, но и в криминалистике, экспериментальной медицине, создании генетических паспортов, мониторинге состояния окружающей среды, анализе продуктов питания, фармакологии, ветеринарии.

Оценить наличие возбудителя инфекции в организме иногда не так просто. Именно поэтому ПЦР-диагностика получила такое широкое распространение в медицинской практике. Она является более точным и надежным методом, чем многие другие аналитические способы, и имеет ряд явных преимуществ:

С помощью ПЦР-метода можно непосредственно определить наличие возбудителя инфекции. К примеру, иммуноферментный анализ (ИФА) выделяет только белки-маркеры, которые являются побочным продуктом жизнедеятельности микроорганизмов, и поэтому указывает на наличие инфекции косвенно. С другой стороны, ПЦР-анализ выявляет специфические участки в ДНК и с большой точностью указывает на присутствие конкретной инфекции.

Высокая специфичность ПЦР-диагностики обусловлена тем, что в исследуемом материале выявляются лишь фрагменты ДНК, которые характерны только для определенных возбудителей инфекции. Это исключает вероятность ложных результатов анализа, чего неизбежно можно заблюдать в иммунологических методах, где ошибки возникают из-за перекрестной реакции антигенов.

ПЦР-диагностика также отличается от многих других методов высокой чувствительностью. Она позволяет выявить наличие даже единичных клеток вирусов или бактерий в таких случаях, когда обычными методами сделать это практически невозможно. Например, ПЦР позволяет выявлять всего 10-100 клеток в пробе, в то время как при использовании иммунологических и микроскопических тестов для определения инфекции необходимо иметь не менее 103-105 клеток.

Применение универсальных методов лабораторных исследований, которые диагностируют сразу несколько возбудителей из одной биологической пробы, является еще одним плюсом ПЦР-диагностики. Этот метод может применяться для выявления возбудителей инфекции не только в организме человека, но и в почве, воде, продуктах питания и других материалах.

Скорость получения результатов является еще одним преимуществом ПЦР-диагностики. Поскольку для проведения анализа не нужно производить посев и выделение культуры возбудителя, то и большого количества времени не требуется. Весь цикл от забора биоматериала до получения результатов занимает всего 4-5 часов.

В заключение, метод ПЦР-диагностики известен своей способностью диагностировать трудно культивируемые и некультивируемые формы микроорганизмов, которые могут вызывать скрытые инфекции.

Ограничения ПЦР-диагностики

Несмотря на то, что метод ПЦР-диагностики считается весьма эффективным, у него все же имеются ограничения. Однако их количество настолько мало, что это не может негативно сказаться на популярности и результативности данного метода.

Вероятность амплификации ДНК возбудителя может сохраняться даже после его гибели. При проведении теста для контроля эффективности лечения, необходимо учитывать определенные требования, в частности, проводить его через некоторое время после полного исчезновения возбудителя инфекции в организме – обычно это занимает от 1 до 2 месяцев.

Существует возможность возникновения перекрестной реакции. Праймеры – это фрагменты ДНК, подбираемые на основе знаний о генетической структуре конкретного возбудителя. Теоретически, такой же фрагмент может находиться в геноме других микроорганизмов, генетический код которых еще не расшифрован. Их наличие в тест-пробе может привести к неверному результату анализа.

Микроорганизмы могут изменяться, что может усложнить анализ при помощи ПЦР-диагностики. Иногда возникновение некоторых штаммов возбудителей может не выявляться в результате таких анализов.

В целях снижения рисков возникновения ошибочных результатов разработаны стандарты объемов испытаний тест-систем ПЦР-диагностики, включающие проверку на перекрестные реакции и тестирование всех известных штаммов конкретного возбудителя.

Метод ПЦР является одним из самых точных для выявления микроорганизмов в биоматериале. Весь процесс диагностики проводится в специальной лаборатории и состоит из нескольких этапов.

Первый этап - забор биоматериала. Это происходит в процедурном кабинете соответствующего профиля. Для исследования используются эпителиальные соскобы со слизистых оболочек, моча, мокрота, кровь, биологические жидкости и биоптаты. При этом необходимо соблюдать правила стерильности и избегать попадания следов крови в материал.

Второй этап - хранение и транспортировка биоматериала. Образцы хранятся при комнатной температуре не более 2 часов. Для длительного хранения пробы помещают в холодильник с температурой 2–8°С на срок не более одних суток или в замороженном виде при температуре -20°С. При транспортировке биоматериала необходимо соблюдать все правила, используя специальные термоконтейнеры или термосы.

Третий этап - выделение ДНК из образца. Для каждого вида образца используется свой метод выделения. Например, для анализа соска эпителиальных клеток используется метод твердофазной сорбции.

Четвертый этап - проведение ПЦР. Некоторое количество образца из биологической пробы переносится в специальную микроцентрифужную пробирку, где проводится амплификация микроорганизмов. Одновременно проводятся контрольные пробы.

Пятый этап - регистрация результатов. Фрагмент ДНК, характерный для возбудителя инфекции, выделяют методом электрофореза в присутствии специального вещества. Образец просматривают в ультрафиолетовом свете — наличие светящейся полосы свидетельствует о положительном результате.

Шестой этап - интерпретация результатов исследования. Результаты могут быть положительными или отрицательными. На основании количественного результата можно оценить степень активности заболевания и определить характер лечения.

Стоимость ПЦР-диагностики: Что влияет на цену?

Цена на ПЦР-диагностику может очень сильно варьироваться и зависит от нескольких факторов. Как отмечается в статье, стоимость анализа зависит от конкретной инфекции, на которую пациент планирует проверяться, а также от вида анализируемого материала и методики тестирования - качественной или количественной. В разных медицинских клиниках цена за определение одной инфекции может варьироваться от 200 до 800 рублей.

Но это не все затраты, связанные с проведением ПЦР-диагностики. К стоимости анализа добавится оплата за забор биоматериала, которая составляет около 400 рублей. Примерные цены на анализы ПЦР в Москве приведены в таблице 1, где указаны цены на определение ДНК и РНК различных инфекций и вирусов.

Кроме того, многие медицинские центры предлагают провести ПЦР-исследование комплексно, включая несколько анализов в одном пакете услуг. Например, «ПЦР-8», который включает в себя восемь бактериальных и вирусных возбудителей острых кишечных инфекций, обойдется в 1400 рублей, а «ПЦР-12», включающий 12 половых инфекций, - в 3500 рублей. Комплексное проведение анализов позволяет существенно сэкономить деньги, поскольку отдельное прохождение ПЦР-диагностики для каждой инфекции будет гораздо дороже.

Фото: freepik.com